Padi (Oryza sativa L.) merupakan tanaman pangan yang sangat penting di Indonesia. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk meningkatkan produktivitas padi adalah menyediakan bibit unggul yang bebas dari serangan hama dan penyakit. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan metode kultur in vitro, dengan tahap awal pembentukan kalus. Salah satu faktor esensial yang mempengaruhi induksi kalus suatu eksplan tanaman yang ditumbuhkan pada medium in vitro adalah penambahan hormon pertumbuhan. Auksin adalah salah satu hormon pertumbuhan yang berperan penting dalam induksi kalus biji padi berbagai varietas. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk melihat pengaruh variasi hormon 2,4 D terhadap induksi kalus biji padi Nipponbare. Kalus yang dihasilkan pada penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya yaitu untuk menghasilkan tanaman padi transgenik yang tahan terhadap hama. Variasi kadar hormon 2,4 D yang digunakan yaitu 0, 1, 2, 3 dan 4 ppm. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap dengan 5 perlakuan untuk setiap ulangan. Tahapan penelitian meliputi sterilisasi ruangan dan peralatan, pembuatan medium MS, sterilisasi medium, sterilisasi dan inokulasi eksplan ke medium. Adapun parameter yang diukur meliputi berat basah kalus, morfologi kalus, kecepatan pembentukan kalus, dan prosentase eksplan membentuk kalus. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa variasi kadar hormon 2,4 D memberikan respon induksi kalus biji padi yang berbeda. Perlakuan tanpa penambahan hormon 2,4 D menghasilkan biji yang tumbuh menjadi planlet tanpa pembentukan kaalus, sedangkan perlakuan dengan penambahan hormon 2,4 D menghasilkan respon biji yang tumbuh menjadi tunas terlebih dahulu kemudian dari tunas terjadi pertumbuhan kalus. Penambahan hormon 2,4 D sebesar 2 ppm mampu memacu pertumbuhan kalus paling baik yang ditunjukkan dengan berat basah kalus yang paling tinggi, morfologi kalus yang remah, paling cepat (5 hari), serta prosentasi pertumbuhan eksplan membentuk kalus paling tinggi. Saran untuk penelitian selanjutnya adalah pengukuran kecepatan eksplan membentuk kalus tidak dilakukan dengan satuan hari tetapi per 12 jam. Selain itu untuk meminimalkan kontaminasi perlu penambahan senyawa tertentu pada medium sehingga pertumbuhan jamur dan bakteri dapat dihambat.